Белок-нуклеаза Cas9 - NLS

Описание

Белок Cas9-NLS - это рекомбинантная эндонуклеаза Cas9 из Streptococcus pyogenes слитая c С-конца с повторяющимся сигналом ядерной локализации (NLS) вируса SV40 (PKKKRKV), размер белка составляет 163 кДа. Эндонуклеаза Cas9-NLS в комплексе с направляющими РНК (дуплексом crRNA:tracrRNA) или единой sgRNA осуществляет сайт-специфический гидролиз фосфодиэфирной связи в двухцепочечной ДНК. Разрыв происходит на цепи ДНК между третьим и четвертым нуклеотидами от последовательности РАМ (NGG – мотив, прилегающий к протоспейсеру) с образованием «тупых концов». 

Рисунок: схема расщепления ДНК с помощью комплекса sgRNA:Cas9-NLS.

Источник. Эндонуклеаза Cas9-NLS очищена из штамма E.coli, содержащего плазмиду с клонированной ДНК, состоящей из гена Cas9 и фрагментов ДНК дополнительно кодирующих с N-конца 17 аминокислот и 22 аминокислоты с С-конца. Такая конструкция позволяет синтезировать полностью функциональный белок Cas9 Streptococcus pyogenes, слитый с дважды повторяющимся NLS вируса SV40.

Стандартная концентрация продукта: 20 мкМ (20 пмоль/мкл)

Минимальная фасовочная единица: 300 пмоль (15 мкл).

Буфер хранения: 300 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 50% глицерин (pH=7,5 при 25°C).

*Стандартный буфер для проведения реакции гидролиза плазмидной ДНК: 20 мМ HEPES, 125 мМ KCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 6 мМ MgCl₂, 7% глицерин (pH 7.5 при 25°C).

Оптимальная температура реакции: 37°С.

Спецификация продукта (контроль качества)

Контроль качества. Каждая партия фермента проходит тестирование на электрофоретическую чистоту белка, активность фермента, отсутствие неспецифической эндонуклеазной активности. Чистота фермента составляет ≥95% (SDS-PAGE), неспецифическая эндонуклеазная активность отсутствует.

Проверка специфической активности (целевое расщепление): инкубирование 10 мкл реакционной смеси, содержащей 8 нМ целевой плазмидной ДНК, 400 нм специфичной sgRNA, и 400 нм Cas9-NLS, в стандартном буфере* для проведения реакции в течение 1 часа при 37⁰С приводит к целенаправленному гидролизу субстрата ДНК и превращению плазмиды в линейную форму на 90%.

Проверка неспецифической активности (расщепление нецелевой ДНК в присутствии sgRNA): инкубирование 10 мкл реакционной смеси, содержащей 8 нМ контрольной плазмидной ДНК (не содержащей целевого участка гидролиза), 400 нМ sgRNA (не имеющей комплементарности к контрольной плазмиде) и 400 нМ Cas9-NLS, в стандартном буфере* для проведения реакции в течение 1 часа при 37⁰С превращает не более 10% плазмидной ДНК в никированную форму.

Проверка неспецифической активности (расщепление целевой ДНК в отсутствие sgRNA): инкубирование 10 мкл реакционной смеси, содержащей 8 нМ плазмидной ДНК и 400 нм Cas9-NLS, в стандартном буфере* для проведения реакции в течение 1 часа при 37⁰С превращает не более 10% плазмидной ДНК в никированную форму.

Анализ чистоты белка (SDS-PAGE) - Cas9-NLS имеет чистоту ≥95%, при анализе в SDS-PAGE и окрашивании геля Coomassie Blue.