1.   Набор D-Tissues для выделения ДНК из тканей животных

Мы проводили выделения из различных спиртовых фиксаций животных с разным сроком фиксации, объем ткани для выделения каждый раз несколько отличался, так как не всегда была возможность его адекватно взвесить из-за наличия в образце не только мягких тканей (чешуйки, кости, кутикула насекомых, перисарк книдарий). Выделение проводилось согласно предоставленному протоколу, лизис тканей проводился при температуре 56°С в течение 2 часов с периодическим перемешиванием. Измерение концентрации полученной ДНК проводилось непосредственно после выделения с помощью спектрофотометра Allsheng Nano 500.

1)      Итальянская стенная ящерица, Podarcis siculus (Северный Кавказ), палец, фиксация в 96% спирту, хранение в течение 2-3 месяцев при комнатной температуре. Концентрация полученной ДНК 6,93 нг/мкл;

2)      Полевка, вид неизвестен, (Нарьян-мар), участок мышцы задней ноги, фиксация в 96% спирту, хранение в течение 2 месяцев при -80°С. Концентрация полученной ДНК – 194,04 нг/мкл;

3)      Сидячая медуза Haliclystus auricula (Белое море), целиком, фиксация в 70% спирту, хранение в течение года при +4°С. Концентрация полученной ДНК 60,87 нг/мкл;

4)      Немертина Cyanophthalma obscura (Финский залив), целиком, фиксация в 96% спирту, хранение в течение двух дней при +4°С. Концентрация полученной ДНК 14,21 нг/мкл;

5)      Колония гидроидных полипов Cordylophora caspia (Финский залив), целиком, фиксация в 96% спирту, хранение в течение двух дней при +4°С. Концентрация полученной ДНК 16,73 нг/мкл.

Для трех последних образцов получены последовательности участка 1 субьединицы цитохромкосидазы HCO2198/LCO1490 длинной 650-700 п.н. с удовлетворительным качеством сиквенсов.

2. БиоМастер HS-Taq ПЦР-Color (2×)

ПЦР проводили с образцами комаров рода Aedes (плато Путорана) со стандартными праймерами к участку 1 субьединицы цитохромкосидазы HCO2198/LCO1490 и губками рода Sycon со специфическими праймерами к участку 28S.

Обозначения: LD – маркер длин ДНК, AG1-20 – образцы комаров, S13-S17 – образцы губок, K- отрицательный контроль.

3. Набор для выделения ДНК из FFPE образцов тканей

Проводили выделения из различных музейных образцов животных, использовались участки мягких тканей, или животное целиком. Перед лизисом ткани дополнительно гомогенизировались с помощью пестика.

1)      Гидроидная медуза Tiaropsis sp. (Баренцево море), фиксация в 4% параформальдегиде на фосфатном буфере, дальнейшее хранение в течение 2 лет при +4°С. Концентрация полученной ДНК – 74,40 нг/мкл.

2)      Погонофора Galathealinum sp. (Карское море), фиксация в 10% формалине, хранение в течение 4 лет при комнатной температуре. Концентрация полученной ДНК – 69,07 нг/мкл.

3)      Погонофора Siboglinium sp. (Карское море), фиксация в 10% формалине, хранение в течение 4 лет при комнатной температуре. Концентрация полученной ДНК – 5,2 нг/мкл.

4. Фьюжн 2.0 полимераза

ПЦР проводили с образцами, выделенными с помощью Набора для выделения ДНК из FFPE образцов тканей (пр. пункт), а также с помощью набора D-Tissues для выделения ДНК из тканей животных (более поздние выделения из различных книдарий, спиртовые фиксации, хранение в течение 2-3 дней при -20) согласно приведенному протоколу со стандартными праймерами к участку 1 субьединицы цитохромкосидазы HCO2198/LCO1490.

Обозначения: LD – маркер длин ДНК, Tia - Tiaropsis sp., Cor – Cordylopora caspia, Sib - Siboglinium sp., Gal - Galathealinum sp., Cot – Cotylorhiza sp., Lin – Linuche sp., Mas – Mastigias sp., K- отрицательный контроль.

Выделение ДНК из экскрементов северного оленя набором D-soils-5

1)Использовано 3 образца, собранные весной 2016 года. До проведения экстракции ДНК хранились при -21 C. Ранее из этих образцов уже была выделена ДНК и успешна проведена амплификация 16 микросателлитных локусов.

2) От каждого образца взята навеска по 230 г и 440 г.
3) Все этапы выделения шли в соответствии с протоколом

а) Объем смеси после добавления буфера SB, где была навеска 440 г, составил примерно 1,2 мл; где 230 г- 0,9 мл.

б) До добавления к супернатанту 150 мкл буфера PB, объем перенесенной смеси составил примерно 500 мкл.

образцы после внесения буфера PB

в) После центрифугирования супернатанта, объем перенесенной в новую пробирку смеси составил 550-600 мкл, к нему добавлен буфер BB 600 мкл.

г) Объем элюции ДНК во всех образцах 100 мкл, раствор был прозрачный.
Дополнительной очистки ДНК не проводилось.

Далее выполнена ПЦР с набором CorDis Rangifer в объеме 12,5 мкл для каждого образца, из которых 4 мкл ДНК, 1 мкл воды, 5 мкл реакционная смесь и 2,5 мкл раствор активатора.
Визуализация полученных ПЦР-продуктов проведена на одноканальном генетическом анализаторе Qsep1-Plus от фирмы Bioptic, использовано 10 мкл раствора ПЦР-продукта.

Результаты фореза:
Представлены аллели 16 микросателлитных локусов без разделения по 4 каналам.

Во всех образцах наблюдались алелли, длиной от 111 до 445 п.н.

Образец №1 навеска 230 г

Образец №1 навеска 440 г

Образец №2 навеска 230 г

Образец №2 навеска 440 г

Образец №3 навеска 230 г

Образец №3 навеска 440 г

В нашей лаборатории длительное время стояла задача подбора оптимального метода выделения РНК из сложных тканей, который сочетал бы экономическую доступность, удобство в работе и стабильно высокое качество получаемых препаратов. После тестирования различных коммерческих решений мы были вынуждены использовать аналог TRIzol, несмотря на его технологические неудобства, поскольку альтернативные наборы либо отличались высокой стоимостью и длительными сроками поставки, либо не обеспечивали достаточного качества выделенной нуклеиновой кислоты.

Обратившись в компанию "Биолабмикс", мы получили квалифицированную консультацию по подбору оптимальных решений для наших задач.

Результаты тестирования:

Наборы LRU (колоночный метод) и LR (метод осаждения)

Биоматериал: свежезамороженные образцы мышечной ткани и жабр зеркального карпа

Набор "ЛИРА" продемонстрировал исключительную эффективность выделения с минимальной контаминацией ДНК (результаты подтверждены ОТ-ПЦР в реальном времени).

Колоночный формат (LRU) вообще супер все быстро и технологично получается

Наборы RUplus и Rplants)

Исследуемые образцы: аналогичные

Данные наборы превысили все наши ожидания по выходу конечного продукта