Разработка системы для генотипирования

Описание

Исследование генетической изменчивости животных и растений расширило понимание механизмов эволюции и заболеваний человека, ускорило разработку лекарств, а также помогло обнаружить и культивировать полезные сельскохозяйственные свойства организмов, что улучшило обеспечение всего человечества продовольствием и топливом. Целью ученых является выявление связи между генетическими особенностями организма и его фенотипом путем анализа однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), вариации числа копий (CNV), инсерций/делеций (indel) и соматических мутаций. Мы предлагаем услугу по разработке наборов для генотипирования биологических образцов растительного или животного происхождения (SNP-анализ). Генотипирование проводится путем определения однонуклеотидных полиморфизмов методом KASP (Kompetitive Allele Specific PCR). 

Метод генотипирования KASP основан на конкурентной аллель-специфической ПЦР и позволяет определить в обоих аллелях однонуклеотидный полиморфизм, а также вставку или делецию специфического участка. К образцу ДНК добавляют смесь специфических к SNP праймеров и универсальную для генотипирования 2-х кратную реакционную смесь (мастермикс), затем проводят полимеразную цепную реакцию с последующим считыванием флуоресценции по конечной точке. Смесь специфических праймеров содержит два универсальных FRET-зонда и три сиквенс-специфических, не меченных праймера: два прямых аллель-специфических праймера и один общий обратный праймер. Аллельспецифические праймеры содержат уникальные хвостовые последовательности, соответствующие универсальным FRETзондам (флуоресцентная резонансная передача энергии): один с маркирован FAM ™, а другой - с красителем HEX ™. 

Универсальная 2-х кратная реакционная смесь содержит HS-Taq ДНК полимеразу, смесь никлеозидтрифосфатов, ионы Mg2+, оптимизированный буфер и референсный краситель ROX (если требуется). Вовремя ПЦР соответствующий аллель-специфический праймер связывается с матрицей и удлиняется, тем самым присоединяя хвостовую последовательность к вновь синтезированной нити. В последующем цикле ПЦР синтезируется нить, содержащая комплиментарную последовательность аллель-специфической хвостовой части и являющуюся сайтом связывания FRET-зонда. В связанном состоянии FRET-зонд постоянно светит, так как флуорофор и гаситель разведены. 

Двуаллельная дискриминация достигается за счет конкурентного связывания двух аллель-специфических прямых праймеров. Если генотип в данном SNP является гомозиготным, будет генерироваться только один из двух возможных флуоресцентных сигналов. Если генотип гетерозиготный, генерируется смешанный флуоресцентный сигнал.