Наиболее распространённой системой геномного редактирования является CRISPR/Cas9. В процессе редактирования генома образуются двухцепочечные разрывы ДНК, которые подвергаются восстановлению системой репарации по одному из двух механизмов негомологичной рекомбинации и гомологичного соединения концов, что практически всегда приводит к возникновению различных мутаций. Наиболее распространёнными мутациями являются делеции или инсерции разной длины. Также в области редактирования можно обнаружить инверсии, однако их появление происходит значительно реже.

Для определения наличия мутаций используют несколько основных подходов. Наиболее быстрый и простой способ – это анализ методом гель-электрофореза продукта ПЦР с целевой области генома. Для того, чтобы провести ПЦР, необходимо предварительно из исследуемого образца выделить ДНК любым удобным способом (см. наборы для выделения «Биолабмикс»).

Наборы для выделения НК

Для того, чтобы ускорить процесс выявления мутаций, компания «Биолабмикс» предлагает использование экспресс-лизис буфера для быстрой подготовки образцов к ПЦР (Fast Lysis Buffer, FL-bio100). Состав данного лизис-буфера подобран и оптимизирован таким образом, чтобы компоненты лизата не ингибировали последующую амплификацию целевого продукта.

Таким образом, для скрининга мутаций в процессе генотипирования, достаточно добавить к образцу Fast Lysis Buffer, и в течение 10 минут инкубировать при температуре 56° C. Затем, после инактивации Протеиназы К, можно проводить ПЦР с использованием 2-3 мкл конечной смеси. Для получения быстрых и качественных результатов амплификации мы рекомендуем использование набора БиоМастер HS-Taq ПЦР-Color (2×) (MHC010-200), в состав которого входят все необходимые компоненты для реакции за исключением праймеров и матрицы. Смесь окрашена в зеленый цвет и обладает повышенной вязкостью, поэтому она готова к нанесению на гель сразу после завершения процесса амплификации.

Однако необходимо учитывать, что электрофорез в агарозном геле позволяет обнаружить лишь протяженные делеции или инсерции, длина которых превышает 100 п.о.

Использование фрагментного анализа с помощью капиллярного электрофореза делает возможным выявление мутации с точностью до 1 нуклеотида. Данный метод предполагает также проведение ПЦР с использованием клеточного лизата, однако важным отличием от классической амплификации является наличие одного флуоресцентно меченного праймера. Компания «Биолабмикс» также осуществляет синтез модифицированных олигонуклеотидов, в том числе и с флуорофорами.

Олигонуклеотиды

Кроме того, для осуществления фрагментного анализа, обладающего высокой чувствительностью, необходимо провести очистку реакционной смеси от различных примесей. Рекомендуем использование набора для выделения ДНК из реакционных смесей (DR-10) от компании «Биолабмикс» для подготовки образца к капиллярному электрофорезу.

Данные, которые могут быть получены в результате проведения указанного эксперимента, представлены в виде одного или нескольких пиков, отражающих длину исследуемых продуктов ПЦР. Затем при сравнении пиков из модифицированных и контрольных клеток, можно точно определить размер полученной делеции или инсерции. При этом детектировать можно как короткие инделы (1 п.о.), так и длинные, не превышающие размер ПЦР-продукта.

Еще одним подходом к определению точечных мутаций является анализ ПЦР-продукта целевой области генома с помощью секвенирования по Сенгеру. Выбранный метод позволяет определить полную последовательность нуклеотидов в области мутации, следовательно, он предоставляет информацию о точной локализации делеций или инсерций в исследуемом участке ДНК. Кроме того, при использовании секвенирования по Сенгеру можно также детектировать наличие коротких инверсий. Нуклеотидные последовательности в смешанных популяциях или в случае гетерозиготных популяций можно разложить с помощью метода декомпозиции, для этого удобно использовать некоторые веб-инструменты TIDE (Tracking of Indels by Decomposition) или ICE (Inference of CRISPR Edits). В таком случае, будут обозначены все мутации, присутствующие в образце. Однако данный метод имеет ограничение по длине делеции или инсерции. С высокой точностью можно детектировать только те инделы, последовательность которых не превышает 50–60 п.о.