Каталог

Амплификация длинных и сложных матриц

В настоящий момент полимеразная цепная реакция является одним из основных методов как для фундаментальных исследований в молекулярной биологии, так и для Диагностики.

1
Амплификация длинных и сложных матриц

Untitled (32).png
В настоящий момент полимеразная цепная реакция является одним из основных методов как для фундаментальных исследований в молекулярной биологии, так и для Диагностики. Однако зачастую некоторые исследователи сталкиваются с затруднениями при постановке ПЦР. В первую очередь это может быть связано с использованием «сложных» ДНК-матриц. К сложным матрицам относят участки генома с высоким содержанием пар GC (более 65%). Кроме того, сложными матрицами также являются участки ДНК, с образованием вторичных и комплексных структур, а также протяженные участки для амплификации. Для работы с GC-богатыми матрицами рекомендуем использование GC-Энхансера (SP012-200/1000). Реактив легко и воспроизводимо улучшает амплификацию мишени и повышает выход реакции. Для того, чтобы получить длинный ПЦР продукт рекомендуем использовать: БиоМастер LR HS-ПЦР (2x) (MH040-100/400), БиоМастер LR HS-ПЦР-Color (2x) (MHC040-100/400), который удобно наносить на гель для последующего электрофореза. Благодаря наличию высокопроцессивной полимеразы pfu, смеси LR являются также эффективными для любых сложных матриц. Для классической ПЦР рекомендуем также наборы БиоМастер HS-Taq ПЦР-Спец (2×) (MH011-200), которые оптимизированы для проведения эффективной и воспроизводимой ПЦР c “горячим” стартом на сложно-структурированных или GC-богатых участках ДНК. В компании Биолабмикс также существует решение для ОТ-ПЦР с использованием сложных матриц – это БиоМастер ОТ-ПЦР–Премиум (2×) (RM05-40/200), в состав которой входит M-MuLV –RH, HS-Taq ДНК-полимераза и Pfu ДНК-полимераза в оптимальном соотношении для протекания обеих реакций и повышения точности. Для обратной транскрипции сложных и длинных фрагментов рекомендуем использовать генетически модифицированную обратную транскриптазу (ревертазу) вируса лейкемии мышей - RNAscribe RT, которая способна синтезировать первую цепь кДНК длиной до 9 т.о. и включать модифицированные основания. Оптимальные условия протекания такой реакции поддерживаются в наборе БиоМастер ОТ-ПЦР-РВ-Экстрим (2×) RM01-80 (400). Кроме того, для эффективного проведения ПЦР с использованием сложных или длинных матриц необходимо выполнять несколько важных условий: 1. Увеличение времени денатурации или температуру для эффективного разделения матриц двухцепочечной ДНК. 2. Уменьшение температуры отжига и элонгации, чтобы улучшить связывание праймеров и термостабильность фермента. 3. Использование целостной ДНК, очищенной от примеси, в случае сложных матриц данный параметр является достаточно значимым. 4. Использование оптимизированных праймеров с максимально близким GC-составом 5. Увеличение количества циклов для повышения выхода реакции. 6. Использование GC-энхансеров и высокопроцессивных ферментов и оптимизированных композиций ферментов.