1

Как работает геномное редактирование?

2

История развития инструментов для геномного редактирования:

3

Геномное редактирование с помощью метода CRISPR/Cas9

Обратите внимание, что хотя последовательность PAM сама по себе необходима для расщепления, ее не следует включать в единую последовательность направляющей РНК.

В случае использовании вектора, который непрерывно нарабатывает большое количество нуклеазы, в модифицированной клетке значительно повышается риск появления неспецифических мутаций, поэтому в настоящий момент наиболее целесообразным методом является доставка систем редактирования именно в виде РНП, где количество нуклеазы строго лимитировано.

Помимо белка Cas9 для формирования RNP комплекса необходимо получить последовательность для sgРНК. Для этого рекомендуем «Набор для проведения T7-транскрипции in vitro» (T7-tr-20, T7-tr-100).

Принцип действия набора основан на ферментативном синтезе молекул РНК на ДНК-матрице при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага T7. В состав набора входят все необходимые реагенты для получения высокого выхода РНК-транскриптов за минимальное время реакции. Для того, чтобы получить корректную последовательность олигонуклеотида для синтеза направляющей РНК необходимо с 5´- конца добавить последовательность промотора Т7: TTCTAATACGACTCACTATA

После того, как оба компонента RNP комплекса готовы, необходимо выполнить его доставку в клетки наиболее подходящим способом. В настоящий момент существует большое количество различных методов доставки, например: микроинъекция, электропорация, микрофлюидика и многие другие.

Не менее важным этапом в экспериментах с использованием геномного редактирования является анализ полученных данных.

4

СОЗДАНИЕ СИСТЕМ ГЕНОМНОГО РЕДАКТИРОВАНИЯ

• нуклеазу SpCas9 (E-5030)
• нуклеазу SpCas9 с сигналом ядерной локализации SpCas9-NLS (GE-5030, GE-5050)
• набор для синтеза направляющих РНК «Набор для проведения T7-транскрипции in vitro» (T7-tr-20, T7-tr-100).

5

АНАЛИЗ МУТАЦИЙ В ГЕНОМЕ

Далее для анализа мутаций в геноме клеток в каталоге представлен целый комплекс решений, которые позволяют провести все этапы от выделения геномной ДНК до подготовки образцов к транскриптомному и полногеномному секвенированию.

Для выделения геномной ДНК из модифицированных клеток рекомендуем использование наборов из линейки D для выделения геномной ДНК (DU-10, DU-50, DU-250). Протокол выделения оптимизирован таким образом, что полученная ДНК может сразу быть использована в ПЦР.

Анализ наличия мутаций можно проводить с использованием метода электрофореза в геле или секвенирования по Сэнгеру. Для этого, на первом этапе необходимо провести амплификацию целевых участков генома клеток. Для простых матриц можно использовать стандартные мастермиксы для ПЦР (MH010-200, MH010-1020), а в случае необходимости наработки длинных или GC-богатых регионов лучше сделать выбор в пользу “Long-Range” (MH040-100, MH040-400).

Для того, чтобы облегчить процесс анализа в геле можно использовать наборы с добавленным красителем для прямого нанесения после ПЦР (MHC010-200, MHC010-1020 и MHC040-100, MHC040-400). Электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле позволяет обнаружить значительные делеции или инсерции. Для проведения анализа длины полученных продуктов ПЦР в каталоге Биолабмикс предложен набор ДНК-маркеров от 50 п.н до 10 т.п.н.

Однако для определения коротких делеций или инсерций, а также для выявления нуклеотидных замен необходимо секвенирование целевого фрагмента методом Сэнгера. Для этого полученные продукты из реакции ПЦР можно выделить с помощью Набора для выделения ДНК из реакционных смесей (DR-10, DR-50, DR-250), оценить количество ДНК спектрофотометрически и провести по стандартному протоколу реакцию Сэнгера с последующим анализом с помощью программных пакетов TIDE и ICE для определения мутаций, которые возникли в результате действия системы CRISPR/Cas9.

6

АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА-МИШЕНИ

Для того чтобы выявить изменения функциональной активности целевого участка ДНК, в область которого была направлена система CRISPR/Cas9, можно оценить уровень мРНК или длинной некодирующей РНК гена-мишени в клетке. Для этого удобно использовать готовые мастермиксы для ОТ-ПЦР в режиме реального времени, предложенные в разделах «Наборы для обратной транскрипции» и «Наборы и смеси для ОТ-ПЦР» (названия с учетом названия разделов в новой версии сайта).

Решением, которое обеспечивает качественное и воспроизводимое выделение стабильной суммарной РНК, являются наборы для выделения РНК (RU-10, RU-50, RU-250). Для выделения и анализа коротких форм РНК рекомендуем использование набора для выделения РНК суммарной и микроРНК из клеток и тканей (LRU-100-50)

7

ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ ДЛЯ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО NGS-АНАЛИЗА

Для последующего высокопроизводительного анализа из полученных клеточных линий можно выделить суммарную РНК и короткие формы РНК для транскриптомного анализа (рекомендуем для этого Набор для выделения РНК суммарной и микроРНК из клеток и тканей LRU-100-50) и геномную ДНК для полногеномного секвенирования с помощью NGS-платформ (Набор для выделения ДНК/РНК из мазка/соскоба эпителиальных клеток, вирусов, клеток животных и бактерий PN-100, а также набор новой серии D-cells).