Каталог

Технологии геномного редактирования

Геномное редактирование является одним из самых востребованных методов направленного изменения экспрессии генов в исследованиях по изучению роли отдельных генов и разработке новых подходов к терапии заболеваний. Методы геномного редактирования активно применяются в фундаментальных и прикладных исследованиях.
Технологии геномного редактирования

1
Как работает геномное редактирование?

Редактирование генома — это процесс нацеленного изменения генетического кода организма. Базовый принцип геномного редактирования основан на внесении разрывов в структуру ДНК. В этом процессе участвуют специальные ферменты – нуклеазы. При этом специфичное действие нуклеаз в целевых областях генома осуществляется за счет направляющей нуклеотидной последовательности или специальных ДНК-связывающих доменов. Редактирование может осуществляться несколькими способами. Наиболее распространённый — это внесение двухцепочечных разрывов, которые устраняются системой репарации по механизму негомологичного соединения концов или гомологичной рекомбинации. В таком случае негомологичное соединение концов обычно приводит к удалению протяженных участков или интеграции случайных фрагментов ДНК. Подобные мутации позволяют получить «нокаут» гена, что означает полную и необратимую остановку его экспрессии в клетке. Гомологичная рекомбинация более сложный процесс, который требует наличия «матрицы» для репарации с участками, комплементарными последовательности нуклеотидов, фланкирующих сайт направленного гидролиза.

2
История развития инструментов для геномного редактирования:

Untitled (26).png
Простейшими инструментами были ферменты рестрикции, которые способны разрезать ДНК, в области строго специфичных последовательностей. Подобное ограничение сделало невозможным широкое распространение данного подхода в геномном редактировании, однако рестриктазы продолжают активно использоваться в генной инженерии в качестве инструмента молекулярного клонирования, а также для картирования ДНК.
Для формирования направленного редактирования были получены химерные конструкции «Цинковые пальцы» и TALLEN (от англ. Transcription activator-like effector nucleases). С помощью данных систем уже были получены результаты в работах по направленному изменению структуры генома. Однако процесс создания таких конструкций с белковыми доменами связывания является трудоемким и делает весь процесс подготовки к редактированию. Поэтому появление системы CRISPR/Cas9 способствовало резкому всплеску интереса среди исследователей к данной тематике. Действительно, новая система геномного редактирования значительно упростила весь процесс модификации ДНК. Ее особенностью является то, что она состоит не только из белковой молекулы – нуклеазы (Cas9), которая формирует двухцепоченые разрывы, но и молекулы направляющей РНК, в составе которой находится специфичная последовательность, комплементарная целевому участку генома.
2 - Untitled slide (1).png
Благодаря тому, что система CRISPR/Cas9 может быть нацелена в любую область генома с помощью специальной направляющей РНК, различные модификации Cas9 получили широкое распространите, так как они позволяют не только внести двухцепопчный разрыв в целевой области ДНК, но и провести различные модификации, что значительно расширяет горизонты применения данной системы в будущем. Например, использование системы с инактивированным каталитическим центром нуклеазы (dCas9) позволяет регулировать транскрипцию гена-мишени в результате направленного взаимодействия с промотором. Химерный белок, dCas9, объединенный с ферментом деметилазой, позволяют наоборот избирательно активировать экспрессию целевого гена за счет изменения эпигенетического профиля, а соединение Cas9 c флуоресцентной меткой позволяет визуализировать геномные последовательности. Таким образом, технология CRISPR стремительно развивается и имеет значительный прикладной потенциал для будущих исследований, терапии заболеваний и их диагностики.

3
Геномное редактирование с помощью метода CRISPR/Cas9

Наиболее эффективным и простым методом геномного редактирования является использование система CRISPR/Cas9, которая состоит из двух компонентов направляющей РНК и белка нуклеазы. Направляющая РНК имеет область узнавания длинной 18-20 п.о., которая связывается с комплементарной последовательностью ДНК, называемой «протоспейсером». Как оказалось, направляющая РНК способна взаимодействовать с ДНК только в тех случаях, когда там присутствует специальная последовательность – PAM (protospacer adjacent motif). PAM представляет собой короткую последовательность (длиной обычно 2–6 пар оснований), которая следует за участком ДНК, предназначенным для расщепления системой CRISPR. Канонический PAM представляет собой последовательность 5'-NGG-3', где «N» представляет собой любое азотистое основание, за которым следуют два основания гуанина («G»). Таким образом на первом этапе необходимо правильно подобрать мишень для редактирования и определить последовательность протоспейсера, прилегающего к области PAM в точке вашего интереса.
Последовательность направляющей РНК CRISPR напрямую влияет на эффективность расщепления ДНК-мишени, а также на непреднамеренное связывание и расщепление нецелевой ДНК. Таким образом, разработка правильной направляющей РНК является важным шагом для успеха всего эксперимента. Кроме того, нужно учитывать что GC состав в sgРНК влияет на ее стабильность и их соотношение должно составлять 40-80%. Для того, чтобы подобрать специфическую последовательность направляющей РНК с минимальными нецелевыми эффектами и максимальной эффективностью можно воспользоваться одним из инструментов: Cas-OFFinder, Synthego Design Tool, CRISPOR
Обратите внимание, что хотя последовательность PAM сама по себе необходима для расщепления, ее не следует включать в единую последовательность направляющей РНК.

Существует несколько подходов для проведения экспериментов с использованием системы CRISPR/Cas9 – это трансфекция плазмидного вектора, конститутивно экспрессирующего sgРНК и белок Cas9, доставка компонентов геномного редактирования в составе вирусного вектора и трансфекция рибонуклеопротеидного комплекса (РНП).
В случае использовании вектора, который непрерывно нарабатывает большое количество нуклеазы, в модифицированной клетке значительно повышается риск появления неспецифических мутаций, поэтому в настоящий момент наиболее целесообразным методом является доставка систем редактирования именно в виде РНП, где количество нуклеазы строго лимитировано.
3 - Untitled slide.png
Для проведения высокоэффективного геномного редактирования в различных клетках рекомендуем использование белка Cas9-NLS с двойным сигналом ядерной локализации вируса SV40 (GE-5030), который направляет нуклеазу непосредственно в область клеточного ядра, где она способна в полной мере реализовать свою функцию. Для проведения исследований свойств Cas9 in vitro, рекомендуем использовать рекомбинантный вариант белка Cas9 из Streptococcus pyogenes (E-5030). Данный белок позволяет решать задачи в рамках проведения биохимических исследований, установление констант и кинетики реакции с синтетическими субстратами. Кроме того, белок Cas9 может быть использован для обогащения целевых фрагментов генома с последующим высокопроизводительным секвенированием.

Помимо белка Cas9 для формирования RNP комплекса необходимо получить последовательность для sgРНК. Для этого рекомендуем «Набор для проведения T7-транскрипции in vitro» (T7-tr-20, T7-tr-100). Принцип действия набора основан на ферментативном синтезе молекул РНК на ДНК-матрице при помощи ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага T7. В состав набора входят все необходимые реагенты для получения высокого выхода РНК-транскриптов за минимальное время реакции. Для того, чтобы получить корректную последовательность олигонуклеотида для синтеза направляющей РНК необходимо с 5´- конца добавить последовательность промотора Т7: TTCTAATACGACTCACTATAПосле того, как оба компонента RNP комплекса готовы, необходимо выполнить его доставку в клетки наиболее подходящим способом. В настоящий момент существует большое количество различных методов доставки, например: микроинъекция, электропорация, микрофлюидика и многие другие.

Не менее важным этапом в экспериментах с использованием геномного редактирования является анализ полученных данных.

4
СОЗДАНИЕ СИСТЕМ ГЕНОМНОГО РЕДАКТИРОВАНИЯ

Для использования в виде рибонуклеопротеидных комплексов и для исследований свойств белка Cas9 in vitro портфолио компании включает: • нуклеазу SpCas9 (E-5030) • нуклеазу SpCas9 с сигналом ядерной локализации SpCas9-NLS (GE-5030, GE-5050) • набор для синтеза направляющих РНК «Набор для проведения T7-транскрипции in vitro» (T7-tr-20, T7-tr-100).

5
АНАЛИЗ МУТАЦИЙ В ГЕНОМЕ

Далее для анализа мутаций в геноме клеток в каталоге представлен целый комплекс решений, которые позволяют провести все этапы от выделения геномной ДНК до подготовки образцов к транскриптомному и полногеномному секвенированию. Для выделения геномной ДНК из модифицированных клеток рекомендуем использование наборов из линейки D для выделения геномной ДНК (DU-10, DU-50, DU-250). Протокол выделения оптимизирован таким образом, что полученная ДНК может сразу быть использована в ПЦР. Анализ наличия мутаций можно проводить с использованием метода электрофореза в геле или секвенирования по Сэнгеру. Для этого, на первом этапе необходимо провести амплификацию целевых участков генома клеток. Для простых матриц можно использовать стандартные мастермиксы для ПЦР (MH010-200, MH010-1020), а в случае необходимости наработки длинных или GC-богатых регионов лучше сделать выбор в пользу “Long-Range” (MH040-100, MH040-400). Для того, чтобы облегчить процесс анализа в геле можно использовать наборы с добавленным красителем для прямого нанесения после ПЦР (MHC010-200, MHC010-1020 и MHC040-100, MHC040-400). Электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле позволяет обнаружить значительные делеции или инсерции. Для проведения анализа длинны полученных продуктов ПЦР в каталоге Биолабмикс предложен набор ДНК-маркеров от 50 п.н до 10 т.п.н. Однако для определения коротких делеций или инсерций, а также для выявления нуклеотидных замен необходимо секвенирование целевого фрагмента методом Сэнгера. Для этого полученные продукты из реакции ПЦР можно выделить с помощью Набора для выделения ДНК из реакционных смесей (DR-10, DR-50, DR-250), оценить количество ДНК спектрофотометрически и провести по стандартному протоколу реакцию Сэнгера с последующим анализом с помощью программных пакетов TIDE и ICE для определения мутаций, которые возникли в результате действия системы CRISPR/Cas9.

6
АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА-МИШЕНИ

Для того чтобы выявить изменения функциональной активности целевого участка ДНК, в область которого была направлена система CRISPR/Cas9, можно оценить уровень мРНК или длинной некодирующей РНК гена-мишени в клетке. Для этого удобно использовать готовые мастермиксы для ОТ-ПЦР в режиме реального времени, предложенные в разделах «Наборы для обратной транскрипции» и «Наборы и смеси для ОТ-ПЦР» (названия с учетом названия разделов в новой версии сайта). Решением, которое обеспечивает качественное и воспроизводимое выделение стабильной суммарной РНК, являются наборы для выделения РНК (RU-10, RU-50, RU-250). Для выделения и анализа коротких форм РНК рекомендуем использование набора для выделения РНК суммарной и микроРНК из клеток и тканей (LRU-100-50)

7
ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ ДЛЯ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО NGS-АНАЛИЗА

Для последующего высокопроизводительного анализа из полученных клеточных линий можно выделить суммарную РНК и короткие формы РНК для транскриптомного анализа (рекомендуем для этого Набор для выделения РНК суммарной и микроРНК из клеток и тканей LRU-100-50) и геномную ДНК для полногеномного секвенирования с помощью NGS-платформ (Набор для выделения ДНК/РНК из мазка/соскоба эпителиальных клеток, вирусов, клеток животных и бактерий PN-100, а также набор новой серии D-cells).

Таблица комплексного решения

1
ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ ДЛЯ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО NGS-АНАЛИЗА

Наименование
Каталожный №
Выделений
Цена за шт
Кол-во
Сумма
Наименование
Набор D-cells для выделения ДНК из клеток животных и бактерий
Каталожный №
D-Cells-250
Выделений
250
Цена за шт
33 950 ₽
в корзине
33 950 ₽
Каталожный №
D-Cells-50
Выделений
50
Цена за шт
9 700 ₽
в корзине
9 700 ₽
Каталожный №
D-Cells-10
Выделений
10
Цена за шт
2 500 ₽
в корзине
2 500 ₽
Наименование
Каталожный №
Кол-во, пмоль
Цена за шт
Кол-во
Сумма
Наименование
Белок-нуклеаза Cas9 - NLS
Каталожный №
GE-5050
Кол-во, пмоль
500
Цена за шт
12 300 ₽
в корзине
12 300 ₽
Каталожный №
GE-5030
Кол-во, пмоль
300
Цена за шт
7 300 ₽
в корзине
7 300 ₽
Наименование
Белок-нуклеаза Cas9
Каталожный №
E-5050
Кол-во, пмоль
500
Цена за шт
12 300 ₽
в корзине
12 300 ₽
Каталожный №
E-5030
Кол-во, пмоль
300
Цена за шт
7 300 ₽
в корзине
7 300 ₽