Рис.1. Принцип полимеразной цепной реакции. Процесс ПЦР основан на многократном повторяющемся изменении температуры, что позволяет получить множество копий целевого фрагмента. Основные этапы: денатурация - нагрев и образование одноцепочечной ДНК; отжиг - охлаждение реакционной смеси, связывание праймеров; элонгация – образование новой, комплиментарной цепи ДНК.

Рис.2. Принцип полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Основное отличие ПЦР в режиме реального времени состоит в том, что измерение количества амплифицированной ДНК проходит в реальном времени после каждого цикла амплификации с помощью флуоресцентных зондов или интеркалирующего красителя.

Компания «Биолабмикс» предлагает наиболее обширный перечень реагентов для ПЦР на российском рынке. Мы представляем решения для ПЦР с детекцией по конечной точке, ПЦР в режиме реального времени, а также для ОТ-ПЦР. Подробнее с нашими наборами для ПЦР можно ознакомиться в разделе ПЦР наборы Биолабмикс

Клонирование генов и создание конструкций для наработки биотехнологического продукта:

ПЦР используют для амплификации определенных генов или фрагментов ДНК для последующего клонирования в плазмиды. В результате чего образуются конструкции, способные обеспечить экспрессию целевого продукта. В данном случае необходимо использовать, только те ферменты, которые обеспечивают высокую точность амплификации. Рекомендуем для проведения высокоточной ПЦР использовать ферменты Фьюжн 2.0 полимеразу и Фьюжн ДНК-полимеразу (Pfu-Sso7d) или уже готовый набор для проведения ПЦР с Фьюжн ДНК-полимеразой от компании «Биолабмикс». Перейти в раздел Высокоточная амплификация

После проведения ПЦР необходимо очистить полученный ампликон от более коротких продуктов амплификации и невключившихся мономеров и праймеров, для этого рекомендуем использовать набор для выделения нуклеиновых кислот из реакционных смесей DR от компании «Биолабмикс»

Очищенный от примесей ПЦР-продукт затем клонируют в выбранный вектор. Клонирование может быть достигнуто путем использования специфичных рестриктаз (ферментов, гидролизующих ДНК по специфичным сайтам). Для проведения лигирования рекомендуем использовать Т4 ДНК-лигазу (E-2010, E-2050)

Вектор с клонированным геном затем вносится в хозяйскую клетку, как правило, с использованием методов трансформации, таких как тепловой шок или электропорация, в зависимости от типа клеток. После трансформации клеток проводится отбор клонов, которые содержат вектор со встроенным геном. Обычно используют методы отбора, основанные на селекции, например, на резистентности к определенным антибиотикам. Для контроля встройки нужного фрагмента в плазмиду используют Colony-PCR, мы рекомендуем использовать для этой задачи наборы ПЦР Color: стандартный БиоМастер HS-Taq ПЦР-Color или БиоМастер LR HS-ПЦР-Color в зависимости от длины и «сложности» анализируемого фрагмента. Структуру полученного фрагмента обычно подтверждают секвенированием по Сэнгеру и здесь снова пригодится набор для выделения из реакционных смесей DR для предварительной очистки исследуемого фрагмента.

Таким образом, технология ПЦР многократно используется на пути создания и подтверждения структуры экспрессирующих конструкций, необходимых для биотехнологического производства.

Для того, чтобы полученная конструкция позволила наработать целевой биотехнологический продукт, ее необходимо поместить в систему специализированных продуцентов. К ним обычно относят клетки бактерий, дрожжей, растений и млекопитающих, с адаптированным под синтетические процессы метаболизмом. Полученный биотехнологический продукт не должен содержать никаких примесей. Поэтому, для того чтобы убедиться в его качестве, эффективности и безопасности критически важно оценить отсутствие остаточной ДНК продуцента. ВОЗ был установлен допустимый уровень остаточной ДНК-хозяина для биологических препаратов – от 10 нг до 100 мкг на дозу, в зависимости от линии клеток, режима и частоты дозирования.

Штаммы клеточных линий E. coli относятся к одним из наиболее распространенных суперпродуцентов. Экспрессия терапевтических белков в клетках E. coli является экономически эффективным методом для производства коммерческих количеств лекарственного вещества. СНО (от англ. Chinese hamster ovary) являются клеточной линией эпителиальных клеток, полученных из яичников китайского хомячка Cricetulus barabensis griseus, широко использующейся в научных и медицинских исследованиях, в том числе при коммерческом производстве терапевтических рекомбинантных белковых препаратов.

Для определение остаточной ДНК существует несколько подходов: реакция гибридизации с радиоактивными или флуоресцентными зондами, прямое неспецифическое связывание ДНК с флуоресцентными красителями (PicoGreen, SYBR Green I); а также использование ПЦР со специфическими праймерами.

Рис.3. Системы для количественной оценки примесей «хозяйской» ДНК E. coli и CHO методом ПЦР-РВ.

Наиболее простым и экономически эффективным является количественный анализ с помощью ПЦР в режиме реального времени. Кроме того, данный метод также является точным, стабильным и надежным, что позволяет сохранять уверенность в полученных результатах.

Для проведения количественного анализа необходимо подобрать эффективный метод экстракции, позволяющий выделять остаточную ДНК в субпикограммовых количествах на мл из сложных биологических растворов.

В портфолио компании «Биолабмикс» представлены уже готовые максимально удобные решения для обнаружения и количественного определения остаточной ДНК E. coli или CHO в готовых белковых продуктах

Если в лаборатории есть собственные разработки и подходы для детекции, то можно использовать отдельно оптимизированный и стандартизованный готовый набор для выделения остаточной ДНК (Кат. номер D-Host-100)

Ключевой особенностью наборов «Биолабмикс» для определения остаточной ДНК является оригинальная процедура высокоэффективной экстракции ДНК из сложных растворов, позволяющая получить образец для постановки ПЦР без загрязнений. Что, в свою очередь обеспечивает возможность проведения точной количественной оценки остаточной ДНК клетки-хозяина, и, как следствие, оценить качество выпускаемого биологически активного продукта, согласно установленным ВОЗ нормам.

Системы для количественной оценки примесей хозяйской ДНК E. coli или CHO методом ПЦР-РВ охарактеризованы по специфичности, пределу обнаружения и прецизионности в соответствии с требованиями фармакопеи.

Культуры эукариотических клеток являются неотъемлемой моделью для анализа биологических процессов in vivo. Однако, они очень чувствительны к минимальным имениям окружающей среды, поэтому работа с клетками требует соблюдения надлежащих условий культивирования и стерильности. Наиболее критичной в клеточной работе является контаминация различными микроорганизмами, в особенности микоплазмой.

Микоплазмы представляют собой группу микроорганизмов, которые относятся к классу микробактерий без жесткой клеточной стенки. Для клеточной биологии они могут представлять серьезную проблему из-за высокого риска контаминации. Особенности строения микоплазмы, позволяют ей проникать в стерильные помещения по воздуху, через поры защитных фильтров или с какими-либо предметами, используемыми в работе. Основная опасность микоплазмы заключается в том, что ее появление приводит к изменению «поведения» и скорости роста клеток в культуре, нарушениям в регуляции экспрессии генов и, как следствие, искажению данных и усложнению интерпретации результатов. Инфицированные микоплазмами клетки могут изменять свои фенотипические и биохимические свойства в результате нарушения внутриклеточных процессов.

Рис. 4 Набор для обнаружения микоплазмы Myco-визор

Для того, чтобы в процессе работы с клетками сохранять уверенность в получаемых результатах в процессе культивирования необходимо проверять клетки на предмет контаминации различными микроорганизмами и в особенности микоплазмой. Для этого в компании «Биолабмикс» разработан удобный и надежный набор БиоМастер Myco-визор. Он предназначен для выявления присутствия микроорганизмов семейства Mycoplasma spp. в культурах клеток и других образцах биоматериала методом ПЦР в режиме реального времени с помощью флуоресцентных зондов.

Мы рекомендуем постоянный мониторинг клеточных линий в процессе культивирования, особенно на критических этапах создания культуры, передачи клеточных линий в другие лаборатории и приема клеточных культур из других лабораторий и клеточных банков и коллекций, а также перед запуском дорогостоящих экспериментов.